【文献解读】球磨对桦木、松木、芦苇、核桃壳的酶解抗性及分离出的酶解残渣木质素结构的影响

文章亮点

1)研究了从桦木、松树、芦苇和核桃壳分离出的酶解残渣木质素。

2)延长球磨时间比增加酶负载量更能提高糖的去除率。

3)阐明了酶水解和球磨与不同生物质抗性的相关关系。

4)增强球磨明显降低了分离出的木质素的分子量。

5)在更长时间球磨后，木质素的连接键组成没有严重改变。

背景介绍

木质素是一种丰富的天然芳香族聚合物，占木质纤维生物质的18‒35%。但木质素结构的异质性增加了其实现有效高值化利用的挑战。木质素分离/分级过程很容易影响其化学结构，不同分离方法所获木质素具有完全不同的特性和潜在应用。获取高得率且保留天然C–O键合结构的木质素分离方法是许多新型高端木质素应用的必要前提。酶解残渣木质素的分离就是这样一种方法，该方法通过酶法脱糖并保留木质素的基本结构。研究表明酶解残渣木质素是阐明天然木质素结构的理想选择，并且是研究木质素催化降解的极佳对照。

球磨是最常用的一种机械预处理方法，可以使原料减小尺寸、改变形状，并且破坏纤维素晶体结构，有助于提高糖去除率和木质素回收率。然而，也有研究表明强力球磨特别是振动研磨过程会引起木质素部分氧化和芳基醚键的裂解，同时还会产生新的酚羟基及某些自缩合反应。因此，有必要进一步了解球磨能在多大程度上影响不同植物原料的纤维素酶解性能和木质素结构。

基于此，来自荷兰格罗宁根大学Peter J. Deuss博士课题组的研究人员详细考察了球磨对桦木、松木、芦苇、核桃壳的酶解抗性及分离出的酶解残渣木质素结构的影响。

图文解读

这项工作的目的是高效分离出更接近天然木质素结构且得率高的酶解残渣木质素（Rel），以作为高分子量、高β-O-4含量的基质或模型木质素。此外，还研究了分离过程如何影响不同植物原料的木质素结构，以及高效分离的关键参数（研磨时间、负载量、水解时间）。研究选用有代表性的木质纤维素原料桦树、松树、核桃壳和芦苇（硬木、软木、草类和非木材）进行了评估，探究行星式球磨预处理结合纤维素酶Ctec2酶解对木质素结构的影响。以球磨六小时与一次酶水解为一个周期，可以获得一次（Srel）、二次（Drel）和三次（Trel）酶解木质素；样品一步球磨24h后酶解所获木质素为Srel-24h，详细实验流程如方案1所示。此外，为研究相关参数影响，取用不同球磨时长的样品进行酶解，并使用不同浓度的酶负载量酶解球磨6h后的样品，详细流程说明见方案2。

Scheme 1. Isolation of residual enzyme lignin.

Scheme 2. Schematic guide of the experiments performed for the parameter study.

不同生物样品酶处理后的残余糖分析结果显示，24h球磨可以更有效去除碳水化合物：松树（11.2%）>芦苇（8.9%）>胡桃壳（8.0%）>桦木（6.8%）。而多次酶解球磨步骤中，两步处理也可除去大部分糖。残留糖含量数据表明，样品的生物质抗性应该为核桃壳>芦苇≈松树>桦树。此外，应针对不同的生物质原料调整分离Rel的酶用量。发现从Srel到Srel_2 M和Drel样品颜色逐步加深，这一现象与杂质含量没有直接关系从而不能作为残余碳水化合物存在的标志，而是可能暗示木质素结构的变化。需要指出，单步球磨和酶解比多步球磨和酶解所获木质素得率更高，因为多步处理中更容易造成物料损失。

Fig. 1. Saccharide analysis of different biomass samples before and after enzyme treatment. Starting material (STM) was obtained from smashing with normal grinder with a 20 mesh screen and dewaxing with toluene/ethanol. 

参数研究表明，球磨时间和酶负载量都显著影响除糖效果。随着球磨时间的增加，酶解后残渣含糖下降，延长球磨时间对酶处理效率的提高顺序是松树>桦树>芦苇>核桃壳。酶解残渣中残余的纤维素和半纤维素含量随着酶用量低于0.25 mL_enzyme/g_biomass而逐渐降低，且不同样品中纤维素和半纤维素对酶解的敏感性不同。

Fig. 2. The saccharide analysis of the residues obtained from enzymatic hydrolysis of biomass (2.5 g samples from 30 g starting material) after different ball milling times (0.5 mL_enzyme/g_biomass in 25 mL_buffer/g_biomass) and b) with different enzyme loadings (6 h ball-milling).

以扫描电子显微镜（SEM）监测生物质的颗粒大小和表面形貌表明，球磨可以显著减小生物质的粒径并改变其形态表面，在酶处理后残渣上出现多孔结构。核桃壳与其他生物质样品有明显差异，这可能是由于其具有较高生物质抗性。此外，X射线衍射（XRD）结果表明与其他生物质样品相比，球磨导致核桃壳中纤维素的结晶度损失最小。进一步分析SEM图，长时间球磨后的样品中片状碎片消失，被研磨材料的表面变成了带有裂纹和波纹的粗糙表面。

Fig. 5. 2D HSQC NMR spectra of lignin samples obtained from time course experiments after 24 h and 48 h of ball milling and enzyme treatment with an enzyme load of 0.5 mL_enzyme/g_biomass in 25 mL_buffer/g_biomass. A: Aromatic region, AL: Aliphatic region and anomeric region. The common polysaccharide and lignin label system is used and the signals were colored for convenience. Spectra were recorded by swelling lignin samples in a mixture of DMSO-d6 and pyridine-d5 (v/v, 4:1).

为了详细地了解延长球磨时间所引起的木质素结构改变，研究人员对球磨24小时和48小时后的生物质样品进行酶解，并用凝胶态二维核磁共振（2D-HSQC NMR）表征酶解残渣木质素的结构。此外，选取核桃壳多重残渣酶解处理后的样品，以跟踪多步分离过程中木质素的结构变化。与原始生物质样品相比，球磨后的样品在DMSO-d6/pyrdine-d5中更容易溶胀，使得谱图质量更佳。光谱的强度从Srel到Trel逐渐增加，表明较长的研磨时间和较少的碳水化合物杂质可以产生更好的样品溶胀效果和更高质量的核磁谱图。溶胀较差的样品导致相对较弱的碳水化合物信号和较低的S/G比。半定量分析结果显示，较长研磨时间得到的样品中有较高比例的氧化S型木质素结构单元。但难以界定这一形态变化是否由球磨引起，还是由于纤维素水解混合酶中的某些酶具有更有效的氧化作用。

对四种生物质样品的主要连接键含量和S/G比率未观察到明显的差异，这表明至少在初次球磨后，球磨对木质素结构的影响有限。桦木的β–O–4连接略有减少（<3%），表明加倍的球磨时长可能对木质素中主要的β–O–4连接数量产生轻微负面影响。相比之下，桦木和松木样品的其他连接键含量如β–5和β–β相对有所增加，表明这些连接具有更强的抗性。在松树和芦苇中也观察到这两种连接结构的增加，这可能与光谱质量的轻微改善相对应，而β–O–4信号没有相应的增加，这可能表明其在延长球磨中发生了部分降解。总体而言，本研究显示行星球磨在48 h内并没有严重影响木质素的连接键，这与早期研究所报道长时间振动球磨严重破坏β–O–4键不同。

Fig. 6. Molecular weight distribution of lignin samples obtained from time course experiments after 24 h and 48 h of ball milling and double cycles treatments after enzyme treatment with an enzyme load of 0.5 mL _enzyme/g _biomass at a 25 liquid (mL) to solid (g) ratio. a) lignin samples of pine, b) lignin samples of reed.

使用凝胶渗透色谱（GPC）检测木质素分子量则表明，将球磨时间从24小时延长至48小时，大大降低了木质素的分子量。此外，由于在进行多步酶解分离木质素（Drel）时，在第二次球磨处理中增加了球与残渣的重量比，球磨的效率相对提高。这可能会对增加球磨次数的木质素造成更大的损伤，并解释了为什么多步分离得到的木质素（Drel）的分子量接近甚至低于单次长时间球磨（24 h和48 h）加酶解处理后得到的木质素。这一结果进一步说明了调节分离条件对提高回收木质素质量的重要性。

分析表明，本研究中使用的球磨可以裂解部分木质素从而降低分子量，并裂解小部分β–O–4键，但总体上并没有导致总连接键的显著减少。这一发现对于需要高分子量木质素的特定应用非常重要，它表明高分子量与相对β–O–4键含量并不是衡量降解的充分标准。

结论

研究表明，不同生物质原料的酶解木质素可以通过单次长时间球磨和高酶添加量获取，也可以通过多次短时球磨和相对低的酶负载量实现分离。延长球磨时间或增加球与生物质的重量比只对木质素的总连接键含量略有影响，但会显著降低木质素分子量。相较于酶用量，调整这两个操作参数对于提高酶解脱糖效率更为重要。球磨和酶用量对去除半纤维素的增强作用取决于生物质类型，而四种生物质对酶的抗降解性各不相同，大致顺序为核桃壳>芦苇≈松树>桦树，这使得四种生物质的Rel分离的最佳条件不同。为了获得高纯度和极高分子量的木质素，需要根据生物质原料进行系统性分离条件优化。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.113493

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